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载体设计优化与衣壳改造有助rAAV突破应用瓶颈

rAAV载体设计和衣壳优化改造

 

重组腺相关病毒(recombinant Adeno-associated virus,rAAV)是在腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)的基础上,通过工程改造得到的一种病毒载体,可在体内或体外中高效地递送外源基因,在基因治疗和科学研究等领域中得到广泛应用。早在1995年便有研究人员使用rAAV治疗囊性纤维化疾病。近年来,多款基于rAAV载体的基因治疗药物获得美国食品和药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准,用于治疗遗传性视网膜营养不良和脊髓性肌萎缩症。同时,在活体成像、神经环路标记、基因敲除、基因敲入和基因编辑等方向,rAAV载体的应用为广大科研人员实现基因操作等目的提供了便利。

 

虽然rAAV载体取得了一些成功,但是也面临较多的问题与挑战。比如包装容量较低、某些特定组织或细胞的靶向性不佳、部分血清型的产量较低等,都亟需解决。通过优化rAAV载体的设计和改造衣壳,科研人员逐渐找到解决上述难点的方法。下面给大家介绍rAAV载体的应用痛点和rAAV载体设计与衣壳优化改造的思路。

 

一、rAAV载体的应用痛点

1.包装载量低

rAAV一般只能装载5kb以下的基因片段,超出这个容量,rAAV的出毒量与活性往往大大降低。然而无论用于基因治疗的片段或科学研究上的基因长度,有不少被递送的基因片段大小大于5kb,这大大限制了我们的应用。

 

2.体内预存免疫,降低rAAV有效性

现有的科学研究已经证明,40%~80%的人有针对rAAV的中和抗体。由于体内预存免疫中和抗体的存在,rAAV侵染靶细胞的效率会受到限制。因此,目的片段的表达将会受到影响。

 

3.组织靶向性不佳

针对某些细胞或组织,部分rAAV血清型的靶向性较差或没有合适的血清型。由于rAAV的吸附、入侵、胞内运输、蛋白酶体降解、入核、脱衣壳等步骤都与衣壳蛋白的结构相关,所以衣壳蛋白的结构是影响rAAV靶向特异性的一个重要因素。

 

4.转导能力低、安全性风险高

部分rAAV血清型的转导能力低,往往需要较高剂量才能实现目的基因的递送。但会导致治疗基因在肝脏富集,产生肝毒性。而rAAV的转导能力是与衣壳蛋白高度相关。

 

5.产量低,生产成本高

作为基因治疗药物,要求rAAV的滴度较高。对于系统性用药,还需要高剂量给药。但rAAV的产量低,且不同血清型的产量不同。这也是rAAV在基因治疗领域中的一个应用难点。已有研究表明,衣壳蛋白对rAAV产量有很大影响。

 

二、rAAV载体设计和衣壳优化改造

1.rAAV载体设计优化

通过优化rAAV载体的设计,能在一定程度上扩大rAAV的装载容量、提高靶向性和降低免疫原性。对于长度过大的基因片段,可以利用rAAV基因组能通过ITR序列或重叠序列之间的同源重组连接成多联体的特性,将目的片段拆分成多个小片段,并包装成两个或多个rAAV病毒,这样便可以扩大递送片段的长度。

 

特异性启动子能使目的基因在特定的组织和细胞类型中表达,但一般而言特异性启动子的活性比CMV等广谱型病毒启动子的低。将特异性启动子与增强子序列结合,可提高特异性启动子的活性。例如,在hAAT启动子的基础上结合了肝脏特异性增强子ApoE,能有效提高目的基因在肝脏的表达水平。此外还可以缩短启动子的长度,以此扩大目的基因的装载容量。

 

还能通过在rAAV基因组的3‘UTR区引入组织特异性表达的miRNA的识别位点,可以有效降低目的基因脱靶的风险和降低免疫原性。比如引入肝脏特异性表达miRNA122a的结合位点,可有效降低肝脏中目的基因的表达。

 

2.rAAV衣壳优化改造

衣壳蛋白对rAAV的转导能力、靶向性、免疫原性和产量有着重要的影响,因此科研人员希望通过优化改造rAAV的衣壳蛋白,从而改善rAAV的适用性。现今,rAAV衣壳的优化改造有四种策略,分别是天然发现、理性设计、定向进化和计算机辅助的定向进化。

 

rAAV载体设计和衣壳优化改造

图1 获得新型rAAV血清型的主要方法[6]

 

现有常用的rAAV血清型大多是天然发现的,但种类较少,难以满足当今的研究需求。因此,不少研究人员从非人灵长类动物等分离出新型的rAAV血清型。但即使通过天然发现的方法,rAAV的种类仍然较少,并且存在前者的应用问题,因此仍需作进一步的优化改造。

 

针对常用的rAAV血清型,在分析其衣壳的结构、侵染过程、体内代谢等方面后,可以通过理性设计的策略改造衣壳,提高rAAV转导率和靶向特异性。常用的方法是在衣壳蛋白的特定位置进行插入和突变修饰。在rAAV衣壳上某些特定的位点插入多肽序列,插入的这些多肽序列不仅不影响rAAV包装和转染,还能特异识别特定细胞类型的表面抗原,从而提高rAAV的靶向特异性。例如在rAAV2的第587位点上插入表达靶向人内皮细胞的多肽序列,可有效提高rAAV2对人内皮细胞的靶向能力。此外通过定点突变,改善衣壳蛋白的结构,也能优化rAAV的功能。比如通过对rAAV2的衣壳进行多个位点突变,经过筛选有效突变,发现有多个突变型rAAV2的功能得到优化。主要体现在免疫中和抗体识别与中和突变型rAAV2的能力大大降低。通过理性设计策略可以有效优化rAAV的功能,但这种策略有较大的缺点,比如依赖科研人员的设计经验、成功概率低和只能发现有限的rAAV衣壳变体等。

 

定向进化策略可以很好地解决理性设计策略遇到的瓶颈。定向进化无需了解rAAV的作用机制、衣壳结构等背景,只需通过随机点突变、体外重组等方法构建高丰度的基因突变文库,再根据实际需求对文库给予筛选压力,经过迭代筛选,富集出目标的新型rAAV变体。应用定向进化的策略,已经筛选出较多的rAAV血清型,比如Tervo等得到了可在神经元内沿轴突逆向运输的突变图rAAV2-retro。虽然定向进化可以筛选到多种的血清型,但是这种策略技术门槛高、周期长和成本高,在一定程度上限制了血清型的改造。

 

对于定向进化遇到的瓶颈,“计算机辅助定向进化”是一个良好的思路和解决方案。特别是人工智能辅助rAAV衣壳蛋白设计的方式,具有高通量、成本低和周期短等优点。其大致的过程是通过构建大型的rAAV载体文库并包装成病毒,经过体内体外实验,并获得数据。将数据用于训练和优化AI模型。再根据实际需求(高滴度、特异靶向、低免疫原性等),用AI模型预测出合适的新型血清型。再经过体内体外的实验验证,判断新型血清型的有效性。AI预测模型能为衣壳蛋白的定向进化和理性设计提供参考,大大提高rAAV优化改造的成功率。

 

rAAV载体设计和衣壳优化改造

图2 基于AI的高效rAAV衣壳蛋白优化流程

 

三、总结

rAAV在基因治疗和科学研究等领域有着广泛的应用前景,但面临诸如靶向性不佳、转导能力低、体内预存免疫等难题。虽然通过优化载体设计能在一定程度上得到解决,但开发新型血清型却能从根本上突破这些瓶颈。为了全面、有效、快捷、低成本地开发新型血清型,AI辅助定向进化这一策略提供了良好的思路。相信在不久的将来,越来越多的新型rAAV将会被发现,便于广大科研人员的研究和造福基因疾病的患者。

 

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