B6-hRHO-P23H小鼠|B6-hRHO-P23H小鼠构建|视网膜色素变性小鼠-赛业生物

产品编号：C001495

品系全称：C57BL/6JCya-Rho^{tm2(hRHO*P23H)}/Cya

品系背景：C57BL/6JCya

传代建议：纯合与纯合互配或杂合与杂合互配

品系描述

视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa, RP）是一种遗传性视网膜疾病，全球患病率约为1:5000-1:3000。RP具有很大的临床和遗传异质性，视紫红质基因（Rhodopsin, RHO）突变导致约25％的显性RP^[1]。RHO编码的视紫红蛋白与视觉光传导和GPCR下游信号密切相关，视紫红蛋白在视觉形成过程中光信号的传导至关重要，大多数RHO突变导致视紫红蛋白在感光细胞中高水平表达，使得大量的突变蛋白在细胞中定位异常并聚集，造成感光细胞凋亡，不能行使正常的光信号传导功能。此外，RHO基因的突变也与先天性静止性夜盲（CSNB）有关。目前靶向RHO基因以治疗视网膜色素变性的基因疗法有ASO、CRISPR等，全人源化动物模型的应用有助于推动RHO相关潜在疗法向临床试验进一步转化。

本模型为小鼠Rho基因人源化模型，利用基因编辑技术将小鼠内源性Rho基因替换为携带P23H突变的人源RHO基因片段，以在小鼠体内表达人源的视紫红蛋白。在该模型中，小鼠Rho基因被携带致病突变（P23H）的人源RHO基因取代，人源基因编码的异常蛋白在小鼠体内表达，因此该模型的视网膜外形和功能存在异常和视觉缺陷。此外，基于自主研发的TurboKnockout融合BAC重组的技术创新，赛业生物还可基于B6-hRHO全基因组人源化小鼠针对不同点突变提供定制服务，以满足广大研发人员关于视网膜色素变性（RP）疾病的药效学等实验需求。RHO基因突变可导致RHO介导的常染色体显性视网膜色素变性（RHO-adRP），在25%的常染色体显性遗传RP（adRP）病例中，有超过150种不同的RHO基因突变体。其中，P23H突变是常染色体显性遗传性视网膜色素变性的最常见原因之一，占adRP病例的10%^[2]。之前的研究显示，携带该突变的杂合小鼠表现为与患者的疾病进展相似的视网膜病变和进行性视网膜变性^[3]，可用于视觉信号传导和视网膜色素变性（RP）的研究。B6-hRHO-P23H纯合小鼠发病比杂合小鼠更早且表型更严重。考虑到纯合小鼠后期失明导致的生长情况和生命周期的不确定性，建议使用B6-hRHO-P23H杂合小鼠进行实验。但也可按照特定的实验需求，选择纯合小鼠进行研究。

构建方式

图1. B6-hRHO-P23H小鼠的基因编辑策略示意图。利用胚胎干细胞（ES）基因编辑打靶技术，将小鼠的Rho基因ATG起始密码子至下游500bp片段替换为人源RHO基因ATG起始密码子至下游500bp片段，并将点突变p.P23H（CCC到CAC）引入人类RHO基因的1号外显子中。

研究应用：视网膜色素变性（RP）、先天性静止性夜盲症（CSNB）及其它视网膜疾病研究。

验证数据

B6J-hRHO-P23H小鼠的视网膜存在异常

图2. 8周龄野生型小鼠（WT）、B6J-hRHO小鼠和4周龄杂合B6J-hRHO-P23H小鼠眼底形态、OCT检测、FFA检测和H&E染色。结果显示，8周龄野生型小鼠和B6J-hRHO小鼠眼底和视网膜形态正常。FFA检测表明杂合B6J-hRHO-P23H小鼠（HET，即hRHO^WT/P23H）眼底血管正常，但OCT检测和H&E染色结果显示，与野生型和B6J-hRHO小鼠相比，杂合B6J-hRHO-P23H小鼠视网膜外核层变薄且视网膜厚度总体变薄。

B6J-hRHO-P23H小鼠视网膜电图（ERG）存在异常

图3. 4周龄野生型小鼠（WT）、B6J-hRHO小鼠和杂合B6J-hRHO-P23H小鼠眼部ERG检测结果。结果显示，与野生型小鼠和B6J-hRHO小鼠相比，4周龄杂合B6J-hRHO-P23H小鼠的暗适应（Scotopic）a波与b波的振幅出现显著降低，而明适应（Photopic）a波与b波的振幅暂未出现显著降低。

靶向RHO小核酸药物可改善B6-hRHO-P23H小鼠的视网膜病变

眼底形态和OCT检测药物治疗前后小鼠的视网膜厚度变化

图4. 杂合B6-hRHO-P23H小鼠经ASO药物处理前后的眼底形态和OCT检测结果。以治疗视网膜色素变性（RP）的ASO药物QR-1123*公开序列和修饰信息为基础，合成与其结构和功能类似的反义寡核苷酸（由金斯瑞合成），并以小鼠双眼玻璃体腔注射的方式进行ASO药物治疗（注射剂量为50μg/μL，2μL/眼），分别在第0、7、14天进行眼底形态和OCT检测以观察小鼠视网膜的厚度变化。结果显示，与溶剂对照组（PBS-treated）相比，ASO处理组小鼠的视网膜厚度（Thickness of retina）明显高于PBS处理组，并且其视网膜厚度减小率（Ratio of thickness reduction）也较低。

*QR-1123是由ProQR研发的反义寡核苷酸药物，用于治疗由RHO^P23H突变导致的常染色体显性色素性视网膜炎（adRP）。该药物与变异的RHO mRNA特异性结合后，通过RNase H介导的裂解机制可特异性沉默突变mRNA而不会影响正常的RHO mRNA^[13]。

视网膜电图（ERG）检测

图5. 杂合B6-hRHO-P23H小鼠经ASO药物处理前后的ERG检测结果。结果显示，在ASO药物治疗后第7天和第14天，与溶剂对照组（PBS-treated）相比，ASO处理组小鼠的暗适应（Scotopic）a波与b波振幅均有明显提高，尤其是在第14天，小鼠暗适应a波显著高于PBS处理组。

罕见病数据中心（RDDC）

基因基本信息

临床突变信息

RHO基因突变导致疾病的发生

人RHO基因位于5号染色体，编码的视紫红蛋白是第一个被鉴定的视网膜色素变性突变蛋白，它是一个位于视杆细胞外段中的G蛋白偶联受体，对于光信号传导至关重要，大多数RHO突变导致紫红蛋白在感光细胞中高水平表达，使得大量的突变蛋白在细胞中定位异常并聚集，造成感光细胞凋亡，不能行使正常的光信号传导功能。目前有超过150个RHO基因突变被鉴定与显性RP相关，其中以错义突变为主。RHO基因突变在欧美人群尤其是美国人群中突变率最高，而在亚洲人群中突变率较低。P23H是第一个被发现的RHO基因突变，在美国患者中约占12%，而在其他国家人群患者中却很少发现^[⁴^]。RHO基因发生P23H突变导致蛋白不能正确折叠，造成内质网压力及细胞毒性，最终导致视杆细胞退化。视紫红质蛋白末端的347编码区则是另一个基因突变的热点，有6个不同的突变类型：P347T、P347A、P347S、P347Q、P347L、P347R，其中P347L最常见，在显性RP中突变率为3.6%，仅次于P23H，国内研究报道P347L是一个较常见突变位点^[⁵^]。关于非编码区功能，有文献报道在RHO的内含子中存在致病突变（g.3811A>G和g.5167G>T），且会导致Pre-mRNA剪切异常^[⁶^]。

目前靶向RHO基因治疗视网膜色素变性的基因疗法有ASO、CRISPR等，全人源化动物模型的应用有助于推动RHO相关的潜在治疗方法向临床试验进一步转化。ProQR公司的ASO药物QR-1123用于治疗与RHO（P23H）突变相关的显性RP的临床试验正在进行（ClinicalTrials.gov标识符：NCT04123626），QR-1123通过抑制突变蛋白的产生治疗疾病，ProQR公司在研发中使用RHO（P23H）随机插入的转基因大鼠作为疾病模型^[⁷^]。张锋创立的Editas公布了其体内基因编辑疗法EDIT-103用于治疗由于RHO突变导致的RP^[⁸^]。EDIT-103是一种不依赖于突变的基于CRISPR/Cas9的基因编辑疗法，递送敲除和替换视紫红质基因中的突变双AAV5载体，以保持感光器功能，可通过视网膜下注射给药，该疗法有望解决150多种RHO突变导致的RP。CRISPR疗法的相关文献中使用到的动物模型包括P23H转基因小鼠、P347S转基因小鼠、hRHO（C110R/WT）人源化小鼠及同时具有多个突变的人源化小鼠模型等^[⁹^-1²^]。不难发现，CRISPR疗法中，疾病模型携带人突变基因是重要的共同因素，人源化疾病模型小鼠是CRISPR治疗走向临床前最好的验证模型。

综上所述，RHO基因是视网膜色素变性的重要致病基因，致病机理复杂，具有很大的临床和遗传异质性。突变中以错义突变为主，且部分致病突变位于内含子中，会导致剪切异常。目前已出现ASO、CRISPR、AAV多种基因疗法，研究者们会使用人源化小鼠开展药物临床前实验。赛业生物开发的RHO全人源化小鼠及在该人源化模型基础上构建的B6-hRHO-P23H小鼠可应用于RP基因治疗的临床前研究。此外，还可针对不同点突变提供模型定制服务。

参考文献

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[13]ProQR Therapeutics. (2024). ProQR Receives Fast Track Designation from FDA for QR-1123 for Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa. Retrieved from ProQR Receives Fast Track Designation from FDA for QR-1123 for Autosomal Dominant：https://www.proqr.com/press-releases/proqr-receives-fast-track-designation-from-fda-for-qr-1123-for-autosomal-dominant