B6-hRho小鼠|Rho基因人源化小鼠模型|视网膜色素变性疾病小鼠-赛业生物

产品编号：C001396

品系背景：C57BL/6J

传代建议：纯合与纯合互配

品系描述

视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa, RP）是一种遗传性视网膜疾病，全球患病率约为1:5000-1:3000。RP具有很大的临床和遗传异质性，视紫红质基因（Rhodopsin, RHO）突变导致约25％的显性RP^[1]。RHO编码的视紫红蛋白与视觉光传导和GPCR下游信号密切相关，视紫红蛋白在视觉形成过程中光信号的传导至关重要，大多数RHO突变导致视紫红蛋白在感光细胞中高水平表达，使得大量的突变蛋白在细胞中定位异常并聚集，造成感光细胞凋亡，不能行使正常的光信号传导功能。此外，RHO基因的突变也与先天性静止性夜盲（CSNB）有关。目前靶向RHO基因以治疗视网膜色素变性的基因疗法有ASO、CRISPR等，全人源化动物模型的应用有助于推动RHO相关潜在疗法向临床试验进一步转化。

本模型为小鼠Rho基因人源化模型，利用基因编辑技术将小鼠内源性Rho基因替换为对应的人源RHO基因片段，以在小鼠体内表达人源的视紫红蛋白。在该模型中，小鼠Rho基因被人源RHO基因取代，人源基因编码的蛋白在小鼠体内正常表达，因此该模型的视网膜外形和功能和野生型小鼠相同，不存在视觉缺陷。该模型可用于视觉信号传导和视网膜色素变性（RP）的研究。此外，基于自主研发的TurboKnockout 融合BAC重组的技术创新，赛业生物还可提供基于该模型构建的热门点突变疾病模型，也可针对不同点突变提供定制服务，以满足广大研发人员关于视网膜色素变性（RP）疾病的药效学等实验需求。

构建方式

利用胚胎干细胞ES基因编辑打靶技术，将C57BL/6J小鼠的Rho基因ATG起始密码子至下游500bp片段替换为人源RHO基因ATG起始密码子至下游500bp片段。

研究应用

视网膜色素变性（RP）研究；先天性静止性夜盲症（CSNB）研究；其它视网膜疾病研究。

模型验证

1. B6J-hRHO小鼠

B6J-hRHO小鼠成功表达人源RHO基因

图1. B6J-hRHO小鼠和野生型小鼠中人源RHO基因表达的检测。利用人源基因的qPCR引物检测小鼠体内人RHO基因的表达，检测结果显示与对照组（B6J）相比，B6J-hRHO小鼠成功在体内表达人源RHO基因。

B6J-hRHO小鼠视网膜形态和视网膜血管正常

图2. 10周龄纯合B6J-hRHO小鼠和C57BL/6J野生型小鼠的眼底和视网膜形态检测。纯合B6-hRHO小鼠在眼底形态（Fundus)、视网膜的光学相干断层扫描（OCT）和眼底荧光素血管造影（FFA）中的结果与野生型小鼠一致，表明B6J-hRHO小鼠的眼部和视网膜形态无明显变化，能够维持正常的视网膜血管和血液循环。(WT: wild-type, HO: homozygote)

B6J-hRHO小鼠视网膜结构和视紫红蛋白蛋白表达正常

图3. 10周龄纯合B6J-hRHO小鼠和C57BL/6J野生型小鼠的视网膜结构和视紫红蛋白（Rhodopsin）表达检测。通过H&E染色和免疫荧光染色分别对B6J-hRHO小鼠和C57BL/6J野生型小鼠的视网膜结构和Rhodopsin蛋白进行检测，检测结果表明B6J-hRHO小鼠呈现正常的视网膜结构和蛋白表达。

B6J-hRHO小鼠视网膜电图（ERG）正常

图4. 纯合B6J-hRHO小鼠和C57BL/6J野生型小鼠的视网膜电图（ERG）检测结果。纯合B6J-hRHO小鼠暗适应（Scotopic）和明适应（Photopic）ERG中a波和b波的振幅均与野生型几乎保持一致，表明该模型小鼠视网膜光感受功能正常。

结果讨论

通过qPCR、OCT、FFA、ERG、H&E染色和免疫荧光等多种实验技术对B6J-hRHO小鼠中RHO基因和蛋白表达、视网膜形态和视网膜功能进行检测，检测结果表明人源RHO基因在B6J-hRHO小鼠中成功表达且可以传导到蛋白水平，同时该小鼠维持正常的视网膜形态和功能。

综上，B6J-hRHO小鼠在RHO基因替换后，表型与野生型相比无异常，可用于后续视网膜色素变性（RP）和其它视网膜疾病的研究，为人类疾病的研究提供有效的工具。

B6J-hRHO-P23H小鼠

B6J-hRHO-P23H小鼠品系策略

图5. B6J-hRHO-P23H小鼠的基因编辑策略示意图。将C57BL/6J小鼠的Rho基因ATG起始密码子至下游500bp片段替换为人源RHO基因ATG起始密码子至下游500bp片段，并将点突变p.P23H（CCC到CAC）引入人类RHO基因的外显子1中。

B6J-hRHO-P23H小鼠存在视网膜的异常表型

图6. 8周龄C57BL/6J野生型小鼠、B6J-hRHO小鼠和4周龄F1代杂合B6J-hRHO-P23H小鼠的眼底形态、OCT检测和FFA检测结果。结果显示，8周龄C57BL/6J野生型小鼠和B6J-hRHO小鼠的眼底和视网膜形态正常。对于在B6J-hRHO小鼠基础上构建的携带人RHO基因致病突变P23H的B6J-hRHO-P23H小鼠，其FFA结果显示，4周龄F1代杂合B6J-hRHO-P23H小鼠眼底血管正常，而OCT结果显示，该小鼠的视网膜外核层变薄，视网膜厚度变薄。

图7. 4周龄C57BL/6J、B6J-hRHO小鼠和F1代杂合B6J-hRHO-P23H小鼠的ERG检测结果。结果显示，与C57BL/6J和B6J-hRHO小鼠相比，4周龄F1代杂合B6J-hRHO-P23H小鼠的暗适应（Scotopic）a波与暗适应b波的振幅出现显著降低，而明适应（Photopic）a波与明适应b波的振幅暂未出现显著降低。

罕见病数据中心（RDDC）

基因基本信息

临床突变信息

知识拓展

人RHO基因位于5号染色体，编码的视紫红蛋白是第一个被鉴定的视网膜色素变性突变蛋白，它是一个位于视杆细胞外段中的G蛋白偶联受体，对于光信号传导至关重要，大多数RHO突变导致紫红蛋白在感光细胞中高水平表达，使得大量的突变蛋白在细胞中定位异常并聚集，造成感光细胞凋亡，不能行使正常的光信号传导功能。

目前有超过150个RHO基因突变被鉴定与显性RP相关，其中以错义突变为主。RHO基因突变在欧美人群尤其是美国人群中突变率最高，而在亚洲人群中突变率较低。P23H是第一个被发现的RHO基因突变，在美国患者中约占12%，而在其他国家人群患者中却很少发现^[2]。RHO基因发生P23H突变导致蛋白不能正确折叠，造成内质网压力及细胞毒性，最终导致视杆细胞退化。视紫红质蛋白末端的347编码区则是另一个基因突变的热点，有6个不同的突变类型：P347T、P347A、P347S、P347Q、P347L、P347R，其中P347L最常见，在显性RP中突变率为3.6%，仅次于P23H，国内研究报道P347L是一个较常见突变位点^[3]。关于非编码区功能，有文献报道在RHO的内含子中存在致病突变（g.3811A>G和g.5167G>T），且会导致Pre-mRNA剪切异常^[4]。

目前靶向RHO基因治疗视网膜色素变性的基因疗法有ASO、CRISPR等，全人源化动物模型的应用有助于推动RHO相关的潜在治疗方法向临床试验进一步转化。ProQR公司的ASO药物QR-1123用于治疗与RHO（P23H）突变相关的显性RP的临床试验正在进行中（ClinicalTrials.gov标识符：NCT04123626），QR-1123通过抑制突变蛋白的产生治疗疾病，ProQR公司在研发中使用RHO（P23H）随机插入的转基因大鼠作为疾病模型^[5]。张锋创立的Editas公布了其体内基因编辑疗法EDIT-103用于治疗由于RHO突变导致的RP^[6]。EDIT-103是一种不依赖于突变的基于CRISPR/Cas的基因编辑疗法，递送敲除和替换视紫红质基因中的突变双AAV5载体，以保持感光器功能，可通过视网膜下注射给药，该疗法有望解决150多种RHO突变导致的RP。CRISPR疗法的相关文献中使用到的动物模型包括P23H转基因小鼠、P347S转基因小鼠、hRHO（C110R/WT）人源化小鼠及同时具有多个突变的人源化小鼠模型等^[7-10]。不难发现，CRISPR疗法中，疾病模型携带人突变基因是重要的共同因素，人源化疾病模型小鼠是CRISPR治疗走向临床前最好的验证模型。

综上所述，RHO基因是视网膜色素变性的重要致病基因，致病机理复杂，具有很大的临床和遗传异质性。突变中以错义突变为主，且部分致病突变位于内含子中，会导致剪切异常。目前已出现ASO、CRISPR、AAV多种基因疗法，研究者们会使用人源化小鼠开展药物临床前实验。赛业的RHO全人源化小鼠及在该人源化模型基础上构建的热门点突变疾病模型可以应用于RP基因治疗的临床前研究，针对不同点突变还可提供模型定制服务。

参考文献

[1] Hartong DT, Berson EL, Dryja TP. Retinitis pigmentosa. Lancet. 2006 Nov 18;368(9549):1795-809.

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